Perbezaan antara penjujukan sanger dan pyrosequencing

Perbezaan utama - penjujukan sanger vs pyrosequencing
 

Penjujukan DNA sangat penting untuk analisis DNA kerana pengetahuan mengenai susunan nukleotida yang betul di rantau DNA tertentu menunjukkan banyak maklumat penting mengenainya. Terdapat kaedah penjujukan DNA yang berbeza. Penjujukan sanger dan pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang berbeza yang digunakan secara meluas dalam biologi molekul. Perbezaan utama antara penjujukan sanger dan pyrosequencing ialah Penjujukan sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menamatkan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida manakala pyrosequencing mengesan pelepasan pyrophosphate dengan menggabungkan nukleotida dan mensintesis urutan pelengkap untuk membaca urutan tepat dari urutan tersebut.

Kandungan
1. Gambaran Keseluruhan dan Perbezaan Utama
2. Apa itu penjujukan sanger
3. Apa itu pyrosequencing
4. Perbandingan sampingan - penjujukan sanger vs pyrosequencing
5. Ringkasan

Apa itu penjujukan sanger?

Sanger Sequencing adalah kaedah penjujukan DNA generasi pertama yang dibangunkan oleh Frederick Sanger dan kolejnya pada tahun 1977. Ia juga dikenali sebagai Penjujukan penamatan rantai atau Penjujukan dideoxy Oleh kerana ia berdasarkan penamatan rantai oleh dideoxynucleotides (ddntps). Kaedah ini digunakan secara meluas selama lebih dari 30 tahun sehingga penjujukan generasi baru (NGS) dibangunkan. Teknik penjujukan sanger membolehkan penemuan urutan nukleotida yang betul atau lampiran serpihan DNA tertentu. Ia berdasarkan penggabungan selektif DDNTP dan penamatan sintesis DNA semasa in vitro Replikasi DNA. Ketiadaan kumpulan 3 'OH untuk meneruskan pembentukan ikatan phosphodiester antara nukleotida bersebelahan adalah ciri unik DDNTPS. Oleh itu, apabila DDNTP dilampirkan, pemanjangan rantai terhenti dan ditamatkan dari titik itu. Terdapat empat DDNTP - DDATP, DDCTP, DDGTP dan DDTTP - digunakan dalam penjujukan Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA apabila ia dimasukkan ke dalam helai DNA yang semakin meningkat dan menghasilkan pelbagai panjang DNA pendek. Elektroforesis gel kapilari digunakan untuk mengatur helai DNA pendek ini dengan saiz mereka pada gel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 01.

Rajah 1: Elektroforesis gel kapilari DNA pendek yang disintesis

Untuk in vitro replikasi DNA, beberapa keperluan harus disediakan. Mereka adalah enzim polimerase DNA, DNA templat, primer oligonukleotida, dan deoxynucleotides (DNTPS). Dalam penjujukan Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tiub ujian berasingan bersama dengan empat jenis DDNTPS secara berasingan. Deoxynucleotides tidak digantikan sepenuhnya oleh DDNTPs masing -masing. Campuran DNTP tertentu (contohnya; DATP + DDATP) dimasukkan ke dalam tiub dan direplikasi. Empat produk tiub berasingan dijalankan pada gel di empat telaga berasingan. Kemudian dengan membaca gel, urutan boleh dibina seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 02.

Rajah 02: penjujukan sanger

Penjujukan sanger adalah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekul. Projek Genom Manusia berjaya diselesaikan dengan bantuan kaedah berasaskan penjujukan Sanger. Penjujukan sanger juga berguna dalam penjujukan DNA sasaran, kanser dan penyelidikan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, pengenalan manusia, pengesanan patogen, penjujukan mikrob dll.

Terdapat beberapa kelemahan penjujukan Sanger:

• Panjang DNA yang disusun tidak boleh lebih daripada 1000 pasangan asas
• Hanya satu helai yang dapat disusun pada satu masa.
• Prosesnya memakan masa dan mahal.

Oleh itu, teknik penjujukan lanjutan baru telah dibangunkan dengan masa untuk mengatasi masalah ini. Walau bagaimanapun, penjujukan Sanger masih digunakan kerana keputusannya yang sangat tepat sehingga kira -kira 850 pecahan panjang pasangan asas.

Apa itu pyrosequencing?

Pyrosequencing adalah teknik penjujukan DNA novel berdasarkan "penjujukan oleh sintesis". Teknik ini bergantung pada pengesanan pelepasan pyrophosphate apabila penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeza: polimer DNA, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.

Proses ini bermula dengan mengikat primer dengan templat DNA tunggal dan polimerase DNA memulakan penggabungan nukleotida yang melengkapi dengannya. Apabila nukleotida bergabung bersama (pempolimeran asid nukleik), ia melepaskan pyrophosphate (dua kumpulan fosfat yang terikat bersama) kumpulan dan tenaga. Setiap penambahan nukleotida mengeluarkan kuantiti equimolar pyrophosphate. Pyrophosphate ditukar menjadi ATP oleh ATP sulfurylase dengan kehadiran APS substrat. ATP yang dihasilkan memacu penukaran luciferase luciferase ke oxyluciferin, menghasilkan cahaya yang kelihatan dalam jumlah yang berkadar dengan jumlah ATP. Cahaya dikesan oleh peranti pengesanan foton atau oleh fotomultiplier dan mencipta pyrogram. Apyrase merendahkan DNTP ATP dan tidak diperbadankan dalam campuran tindak balas. Penambahan DNTP dilakukan sekali pada satu masa. Oleh kerana penambahan nukleotida diketahui mengikut penggabungan dan pengesanan cahaya, urutan templat dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 03.

Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan penjujukan DNA pendek pendek. Ketepatan yang tinggi, fleksibiliti, kemudahan automasi dan pemprosesan selari adalah kelebihan pyrosequencing ke atas teknik penjujukan sanger.

Rajah 03: Pyrosequencing

Apakah perbezaan antara penjujukan sanger dan pyrosequencing?

Ringkasan -penjujukan sanger vs pyrosequencing

Penjujukan sanger dan pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang digunakan dalam biologi molekul. Penjujukan Sanger membina urutan nukleotida dalam urutan dengan menamatkan pemanjangan rantai sementara pyrosequencing membina urutan tepat nukleotida dalam urutan dengan penggabungan nukleotida dan mengesan pelepasan pyrophosphates. Oleh itu, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan pyrosequencing ialah penjujukan Sanger berfungsi pada penjujukan oleh penamatan rantai manakala pyrosequencing berfungsi pada penjujukan oleh sintesis.

Rujukan:
1. Fakruddin, MD, dan Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-alternatif untuk penjujukan tradisional Sanger."American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Penerbitan sains, 02 mar. 2012. Web. 28 Feb. 2017.
2. "Penjujukan Sanger."Penjujukan Sanger - Topik Sciencedirect. N.p., n.d. Web. 28 Feb. 2017

Ihsan gambar:
1. "Didesoxy -Methode" oleh Christoph Goemans (Modifiziert) - Dr. Norman Mauder, Auf Basy Einer Datei Von Christoph Goemans (CC By-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-Seq" oleh Enzo di Wikipedia Bahasa Poland (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" oleh MicrobiologyBytes (CC BY-SA 2.0) melalui Flickr